隨著微生物在酵母飼料、酵素蛋白飼料、復合酶制劑、復合飼用微生態(tài)制劑(益生素)等的固態(tài)發(fā)酵飼料制品中的應(yīng)用和發(fā)展，一些不利和有害微生物在生產(chǎn)中的污染問題也顯得愈來愈突出，它們嚴重影響生產(chǎn)的正常運行和產(chǎn)品品質(zhì)。無疑，這也是各個生產(chǎn)單位的重要研究課題之一，尤其是對于較粗放和敞開式固態(tài)發(fā)酵方式來講，防治雜菌污染實際上是關(guān)系到整個發(fā)酵飼料行業(yè)走向正常生產(chǎn)管理軌道，獲得較為純凈的生物制品的非常重要的一個方面。
    　　筆者認為，治菌不如防菌，對于不利和有害微生物的污染必須采取綜合的防治措施。例如注意清潔衛(wèi)生，選擇性地控制有害微生物生長繁殖的物理化學環(huán)境，采用必要的防腐(細菌)和防霉(霉菌)劑，以及嚴格制定殺菌消毒制度等，這些都是相輔相成的。本文就筆者多年來在國內(nèi)數(shù)家固態(tài)發(fā)酵單位從事技術(shù)指導工作時在雜菌防治方面的一些淺陋經(jīng)驗作一簡單介紹。
    1　微生物污染的來源及其危害
    1.1　空間環(huán)境
    　　發(fā)酵飼料生物制品的生產(chǎn)大多使用曲霉、酵母和一些細菌作為菌種，它們都是各廠家根據(jù)自己的生產(chǎn)目的而分離篩選出的“需要的”有用微生物菌種。廣義而言自然界還包括不同屬性各種性狀的酵母、霉菌、細菌、放線菌；還有病毒、立克次氏體、原生動物和藻類等，它們有的對發(fā)酵有益，有的對發(fā)酵有害甚至是人類的致病菌。不論是有益還是有害，只要不是廠家需要的目的菌，它均屬于“雜菌”范疇。
    　　我們的防治目的主要還是針對有害菌。微生物都很微小，容易附著在人體或物體上，以人為載體到處移動，并從人體或物體上分離到空氣中，附著在灰塵上，到處漂浮。所以，空氣中的雜菌源自于空中的灰塵，車間的灰塵顆粒潔凈度，即象征著無菌程度。
    　　空氣中的雜菌非常復雜，對于有嚴格防菌制度的菌種室而言，空氣中微生物大都為生產(chǎn)中使用的酵母、曲霉孢子或細菌，雜菌較少。但在操作中稍有不慎，也會造成一、二、三級種子污染，進而在四級種子敞開培養(yǎng)時，表現(xiàn)為大量污染而無法使用。污染菌大多為高溫桿菌、黑根霉等，嚴重時出現(xiàn)異味，造成停產(chǎn)待種?？諝猸h(huán)境中雜菌對成品發(fā)酵的影響相對較小。
    1.2　原材料污染源
    　　在各類油料餅粕、麥麩、玉米粉、食品及釀造行業(yè)下腳料、魚粉中，含有大量的霉菌孢子，多為黑根霉，在魚粉中更是含有沙門氏菌和綠膿桿菌等致病性芽孢桿菌，在較潮濕的環(huán)境中及含水較高的培養(yǎng)料上生長極快，原料中又以麥麩的根霉孢子含量最多。當用魚粉作原料之一時，一定要在121℃的溫度下滅菌30min以上才能保證生產(chǎn)安全。
    　　生產(chǎn)中若滅菌不充分，或經(jīng)常在菌種室區(qū)域搬運及使用麥麩等原料，極易造成制種階段污染根霉，在使用100%麥麩作制種培養(yǎng)基時，嚴重的造成里外皆霉，防不勝防。在使用淺盤法生產(chǎn)菌種時，料厚若高于8cm，則易造成物料內(nèi)層的厭氧和高溫環(huán)境，滋生大量桿菌，并產(chǎn)生異味。當然，這也與上一級種子質(zhì)量優(yōu)劣有關(guān)。
    1.3　人體污染源
    　　在按嚴格無菌制度操作的菌種室和有無菌處理要求的場所，發(fā)生污染的最大可能原因是由人體上的微生物混入空氣中而造成的，在1d內(nèi)人體可以釋放出幾億個菌，尤以頭發(fā)中最多。
    　　人體主要微生物分布為：頭發(fā)和頭皮中有許多葡萄球菌，棒狀桿菌及其它革蘭氏陽性細菌；手掌上常有葡萄球菌和芽孢桿菌等；口中常檢出有葡萄球菌、鏈球菌、棒狀桿菌等；耳、鼻、眼中有葡萄球菌、芽孢桿菌、棒狀桿菌及革蘭氏陽性細菌等；人的皮膚表面的菌亦很多；衣服及物品上微生物的類型及數(shù)量則更多；另外還附著有大量霉菌孢子。由于每個人所保持的清潔度不同，其數(shù)量有很大差別。
    　　在種子制作階段，這些微生物很容易進入種子中造成污染。葡萄球菌是一種極難控制的有害細菌，由于某些球細菌的生長繁殖條件與耐滲透壓的生產(chǎn)用酵母相似，故而常常在發(fā)酵階段大量繁殖，使產(chǎn)品出現(xiàn)極為不爽的氣味，嚴重降低產(chǎn)品品質(zhì)。實際上在PH為4.5～5.5的高蛋白基料及高滲水平上的固態(tài)發(fā)酵常出現(xiàn)的污染是球細菌，而極少污染霉菌和桿狀細菌。人體則是造成球細菌污染的根本和主要原因。
    1.4　其它污染源
    　　許多污染源也是相互關(guān)聯(lián)的，例如空氣中的雜菌最難控制，它們來源于物料、物品及人的活動，并漂浮于空氣中。所以最有效的防范措施在于嚴格的衛(wèi)生制度和行為約束制度，然后才是嚴格的空間消毒殺菌和原料滅菌規(guī)程，并注意生產(chǎn)車間的周圍環(huán)境。
    2　污染的檢測
    2.1　用沉降法檢測空氣中微生物
    　　2.1.1操作過程　制備好固體培養(yǎng)基平板，當需要測定空間某處雜菌污染情況時，打開培養(yǎng)皿蓋，暴露一定時間；蓋上培養(yǎng)皿蓋，于適宜溫度下，倒置培養(yǎng)一定時間，觀察比較菌落的多少，鏡檢菌落的類別。
    　　2.1.2注意事項　要分別制備細菌、霉菌等培養(yǎng)基平板，分開測定；暴露的時間根據(jù)具體情況而定，空氣干凈則暴露時間長一些，反之時間短一些；此法只能說明空氣中雜菌污染的大致情況，不能計算空氣雜菌密度；測定的高度、部位視具體情況而定，在同一房間中，最 好分開放置幾個培養(yǎng)皿。
    2.2　接種法計算空氣中雜菌密度
    　　準備好一定體積的無菌水，將一定體積的空氣全部通過無菌水，微生物則被阻留在水中，用一定量的該水接種到培養(yǎng)皿中，進行培養(yǎng)，觀察長菌情況，將數(shù)得的菌落數(shù)進行換算，即可得單位體積空氣中的雜菌數(shù)。
    2.3　原料、人體、污染源中雜菌定性觀察
    　　可采取簡單的取樣、定量定容、無菌地接種到平板上，培養(yǎng)并進行觀察鑒別和計數(shù)。
    2.4　生產(chǎn)中雜菌檢測觀察結(jié)論(見表1)
    表1　雜菌污染情況及根本來源(或“宿主”)　%
    
    污染物 黑根霉 葡萄球菌 桿狀細菌 其它 合計
    一級種子 5 80 14 1 100
    二級種子 10 80 8 2 100
    三級種子 80 15 4 1 100
    四級種子 90 5 4 1 100
    發(fā)酵生產(chǎn) 10 80 8 2 100
    “宿主” 原料 人體 人體、原料 人體、原料 　
    注：表中百分比指該雜菌可能造成污染的程度，并非絕對污染。其它指其它霉菌。“宿主”指某雜菌至少90%以上來源于該污染源。
    　　對于空氣而言，一般只是一種將雜菌從人體和物料上污染到生產(chǎn)物料中的中間介質(zhì)，不是根本的“宿主”，故表中并未列出。
    　　實踐證明，對于最終發(fā)酵產(chǎn)品而言，好氣性球細菌等比較難以控制，許多廠家由于管理不善及技術(shù)不過關(guān)，使產(chǎn)品細菌含量嚴重超標。
    3　雜菌預防措施
    　　本文僅就關(guān)鍵的制種階段的雜菌防治作一簡單的介紹，由表1可知，制種階段易污染黑根霉，嚴重時使制種無法進行下去，嚴重影響菌種活力和質(zhì)量。另外還必須注意葡萄球菌污染，盡管在制種時它不是主要污染菌，但進入發(fā)酵階段則可發(fā)展為主要污染菌。球細菌與桿狀細菌的防治與操作人員的無菌觀念和責任心有很大關(guān)系。
    3.1　菌種生產(chǎn)工藝條件
    　　即培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)環(huán)境條件，這是首先應(yīng)考慮到的。微生物的污染是防不勝防的，盡管有最 先進的設(shè)備，也不能絕對防止它進入培養(yǎng)料中。所以制定一個具有高度選擇性的生產(chǎn)工藝條件是上策，更何況我們都習慣于那些比較粗放簡單的生產(chǎn)方式。
    　　3.1.1配方　生產(chǎn)中切忌采用營養(yǎng)過于豐富或碳氮比極高的培養(yǎng)基配方，在二、三、四級種子階段采用具有馴導作用的配方是很有效的。例如在以菜粕為主原料的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)中，在種子配方中可采用在二、三、四級種子培養(yǎng)基配方中逐步放大菜粕用量的方法，同時配合其它配方技術(shù)，既可有效地防止雜菌污染，又可得到較高的細胞含量。同時，種子也得到了三步馴導，有利于發(fā)酵生產(chǎn)。
    　　過于豐富的培養(yǎng)基的第一個弊端在于細胞生長過旺過快，加上空氣擴散速度跟不上，使物料內(nèi)部產(chǎn)生高溫可達50℃和缺氧環(huán)境，使厭氣性高溫桿菌和球菌大量繁殖，產(chǎn)生不良氣味。其次，在濕度較高的底部會生長成片的黑根霉菌塊。筆者認為，以油料餅粕、淀粉質(zhì)原料復配，使基料蛋白含量在25%～35%為宜，同時加入1.5%～5%的無機鹽(根據(jù)本廠菌種滲透壓耐性而定)，來調(diào)節(jié)滲透壓，抑制雜菌生長，必要時加入鹽酸溶液以調(diào)節(jié)PH值到5.0左右。
    　　3.1.2物料水分和環(huán)境濕度　水分對微生物來說有非常重要的意義，各種營養(yǎng)成分必須先溶解于水，才能被細胞利用。需水量的多少，隨微生物種類而不同，一般來說水分的需要程度是細菌＞酵母＞霉菌。保持環(huán)境的相對濕度也是很重要的，基質(zhì)中的水分，特別是表面部分的含水量，隨空氣中的濕度變化而呈正相關(guān)變化。與微生物的發(fā)育有密切關(guān)系的，不是絕對水分含量(%)，而是水份活性(簡寫為AW)，基質(zhì)中含的水分不能全部為微生物所利用，其中一部分得溶解基質(zhì)的成分，因此與可溶性物質(zhì)少的基質(zhì)相比，可溶性物質(zhì)多的基質(zhì)水分活性就低，微生物的繁殖就相對地不容易?？扇苄晕镔|(zhì)一旦溶于水，水的一部分就捕獲這種物質(zhì)，水的蒸汽壓就會降低，假如純水的水蒸汽壓為P0(25℃)，基質(zhì)中水的蒸汽壓為P(25℃)，則這種基質(zhì)的水分活性AW＝P/P0。
    　　控制基質(zhì)AW對于控制根霉的污染具有很重要的意義，主發(fā)酵酵母菌往往是耐高滲的，所以有意識地在基料中復配一定的無機鹽類，適度地降低水分活性，提高水中滲透壓，可有效地抑制根霉菌的生長，同時又可使基質(zhì)保持較高的絕對含水量，并且不會在培養(yǎng)過程中較快的干涸。另一方面，在后序的生產(chǎn)發(fā)酵中，往往加水比僅1∶0.52～0.62，水活性AW更低，故而在三、四級種子培養(yǎng)料中加入適當鹽類，更有馴導的作用，大大縮短發(fā)酵延滯期。
    　　從表2、表3可知，黑根霉較容易控制并有效地抑制其生長。但對好氣條件下的葡萄球菌來說，其對AW的要求接近于曲霉菌，某些葡萄球菌甚至可耐0.82以下的水活性，它們會在種子擴大培養(yǎng)中累積生長并潛伏下來，在連續(xù)通風發(fā)酵生產(chǎn)中表現(xiàn)出較嚴重的污染。
    表2　某些鹽類飽和溶液所顯示的水分活性(25℃)普通微生物的發(fā)育最低水分活性(AW)
    
    鹽類 AW 鹽類 AW 微生物 發(fā)育的最低AW
    KCl 0.842 K2G2O7 0.980 普通細菌 0.90
    NaCl 0.752 KNO3 0.924 普通酵母 0.88
    KBr 0.807 BaCl2 0.901 普通霉菌 0.80
    MgCl2 0.330 SrCl 0.708 好鹽細菌 ≤0.75
    NaNO3 0.737 Mg(NO3)2 0.528 耐干滲霉菌 0.65
    K2CO3 0.427 K(C2H3O2) 0.224 耐滲酵母 0.61
    表3　一些生產(chǎn)用菌及污染微生物的發(fā)育及AW的關(guān)系
    
    微生物 發(fā)育最低AW 微生物 發(fā)育最低AW
    肉毒桿菌 0.98 玫瑰式小球菌 0.90
    蠟樣芽孢桿菌 0.97 嫌氣金黃色葡萄球菌 0.90
    沙門氏菌 0.95 好氣金黃色葡萄球菌 0.87
    綠膿極毛桿菌 0.94 黑曲霉 0.86
    黑根霉 0.93 灰綠曲霉 0.81
    大腸桿菌 0.92 扣囊擬內(nèi)孢霉 0.769
    八疊球菌屬 0.91 白地霉 0.842
    　
    　　空氣中濕度以70%～80%為宜，過高易滋生霉菌、細菌，過低則基質(zhì)水分散失過快，不利于種子生長。
    　　3.1.3溫度與供氣　料溫不得高于40℃，否則桿狀細菌會大量繁殖，持續(xù)高溫，將使種子過早衰老死亡，得到的種子質(zhì)量、活力不高，發(fā)酵延滯期較長。料溫最 好控制在32℃左右，對于5cm厚的三級種子淺盤培養(yǎng)而言，宜在培養(yǎng)10h后，斷掉培養(yǎng)室內(nèi)熱源。僅靠料溫及種子本身生長產(chǎn)熱維持培養(yǎng)，22h可成熟出料，該法是針對密封性較好的培養(yǎng)室而言的，夏天則應(yīng)注意降溫。對于培養(yǎng)量較大的四級種子生產(chǎn)，則空間應(yīng)注意通風換氣，并且易于控制溫濕度為宜。
    　　3.1.4酸堿度　微生物的生長繁殖受環(huán)境酸堿度(PH值)的影響，與溫度條件一樣，各種微生物有自己最適的PH范圍。一般來說，細菌尤其是有害細菌的最適PH范圍是中性偏堿(PH＝7～8)，大多數(shù)酵母和霉菌的最適PH范圍是弱酸性(即PH＝4～6)，與細菌相比，酵母和霉菌生長的PH范圍較廣些。微生物在超過PH的最適范圍外的環(huán)境中，生長便受到抑制，甚至發(fā)育受阻，因此，控制基質(zhì)的PH，就可控制微生物的繁殖和活動。例如調(diào)節(jié)基料PH在4.0～5.5之間，可控制且遏止有害細菌的生長，而不影響酵母、曲霉的生長。另外，有些發(fā)酵設(shè)施也可采用酸處理的方法來預防雜菌生長，如湖南有家私營企業(yè)，采用竹扁上竹架的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑產(chǎn)品，日產(chǎn)0.5t，年創(chuàng)利潤80多萬元，但細菌產(chǎn)氨味問題一直沒有得到解決。盡管采取了各種遏止方法都無濟于事，成為數(shù)年來的一塊心病。后來發(fā)現(xiàn)，是由于竹扁太多，勞動強度大，在清洗和消毒竹扁時，不能完全殺死竹扁上殘留的細菌。既然無法全部殺死，則最 好的方法是抑制，于是在竹扁清洗后，用1%鹽酸溶液配合消毒水對竹扁進行噴霧處理，曬干后再用于發(fā)酵，就從根本上解決了長時間發(fā)酵(72h)隱藏的產(chǎn)氨味問題。
    　　以上各種工藝條件對于制種來講，應(yīng)是相輔相成的，總之，各種微生物都有自己最適宜的生長條件。因此只要我們有目的地控制這些條件，人為地破壞雜菌的生長條件，就可以防止或減少雜菌的污染。
    3.2　加強原料管理，車間合理布置、嚴格滅菌操作
    　　黑根霉等來源于各類原料，必須加強原料管理。原料必須嚴格滅菌才能進行制種，原料配合和預處理車間必須遠離或隔離于制種車間，杜絕一切使原料在車間內(nèi)頻繁搬動的操作，不使用發(fā)霉結(jié)塊和變質(zhì)的原料，使用的水要干凈清潔。
    3.3　注意環(huán)境衛(wèi)生及個人衛(wèi)生
    　　充實必要的自動化設(shè)備，盡量做到不用手工操作；墻壁天花板的涂料中應(yīng)配合高效低毒的防霉劑以防止發(fā)霉；建立工作服的清潔衛(wèi)生和消毒滅菌制度。對于無菌室、菌種室及培養(yǎng)室建立定期的空間、地面等消毒滅菌制度。
    　　注意車間的通風、除塵、干燥和消毒，盡可能減少和杜絕微生物的污染源。
    　　注意個人衛(wèi)生，在無菌室或其它要求無菌處理的場所，必須采取完全防止從人體釋出微生物的措施。
    　　實驗和操作后，要及時處理現(xiàn)場，尤其是殘留培養(yǎng)基和殘留菌種，要及時地進行清洗和滅菌處理。
    　　在抓好管理的同時，要對職工經(jīng)常進行培訓，培養(yǎng)無菌意識，建立無菌概念，有效的防止雜菌污染。